生化学と分析生化学

概要

ミトコンドリアにおけるROS産生に対するカルシウムの影響をモニタリングするためのプローブとしてのジクロロフルオレセインの使用

オルガ・V・アコポワ、リュドミラ・コルチンスカヤ、ヴァレンティーナ・ノサール

ジクロロフルオレセイン (DCF) は、細胞および単離ミトコンドリアにおける活性酸素種 (ROS) 生成のモニタリングに広く使用されています。私たちの目的は、単離ミトコンドリアにおける Ca2+ 輸送に伴う ROS 形成をモニタリングするための DCF の使用に関するさまざまなアプローチを比較することでした。ROS 生成に対する Ca2+ の影響は、DCF 適用の 2 つのモードを使用してラットの脳および肝臓ミトコンドリアで研究されました。1 つは、DCF 前駆体ジクロロフルオレセインジアセテート (DCFDA) をストックミトコンドリア懸濁液に事前ロードする方法で、もう 1 つは、DCFDA のアリコートをインキュベーション培地に直接添加する方法です。カルシウムは、シトクロム c の段階的な放出と電子の流れのゲーティングによって引き起こされる定常状態と非平衡状態の両方で、脳および肝臓ミトコンドリアにおける ROS 生成を増加させました。 DCF をあらかじめロードしたミトコンドリアを使用して、定常状態における ROS 形成率が Ca2+ サイクリングおよび Ca2+ 刺激呼吸の速度に直線的に依存することを示しました。非平衡状態への移行は ROS 形成の非直線的増加をもたらし、これもまた Ca2+ 濃度に依存していました。DCF をあらかじめロードしたミトコンドリアでは DCF 蛍光は Ca2+ 輸送の時間経過に密接に追従しましたが、ロードされていないミトコンドリアでは、マトリックス空間への DCF 濃度の継続的な変化のために、プローブのロードが ROS 形成の検出を妨げました。実験に基づいて、ミトコンドリアにあらかじめロードした DCF は、Ca2+ 輸送が ROS 生成に及ぼす影響をモニタリングするための適切なプローブとして機能する可能性があるという結論に達しました。