生化学と分析生化学

概要

バイオテクノロジー会議 2015 : フェドバッチプロセスにおける化学修飾システインと CHO 固有の生産性への影響 - Aline Zimmer Merck Millipore

アライン・ジマー

哺乳類細胞の工業用フェドバッチ培養は、モノクローナル抗体などの治療用タンパク質の生産に使用されています。初期成長を確実にする培地の他に、成長、生存率、抗体生産を改善するために給餌が必要です。確立された商用システムには、わずかに酸性の濃縮メインフィードと、L-チロシンとL-システインを含む別のアルカリ性アミノ酸フィードがあります。L-システインは、空気と金属触媒の存在下でシステインに二量化するため安定ではないため、中性pHフィードにすべてのアミノ酸を含めるには、安定したL-システイン誘導体が必要です。これらの単一フィードシステムは、給餌スキームを簡素化し、pHとDOシグナルの両方を安定化することで全体的なプロセス堅牢性を向上させるために好まれています。ここでは、小規模およびバイオリアクターに適用可能な工業用単一フィードフェドバッチプロセスで、化学修飾システインとリンチロシン二ナトリウム塩を組み合わせて使用​​することを提案します。細胞培養実験は、ヒトモノクローナル抗体を発現する CHO 懸濁細胞株を用いて、スピンチューブまたはバイオリアクターで実施しました。生細胞密度と生存率は、自動細胞計数装置を使用して測定しました。使用済み培地の上清の分析は、プレカラム誘導体化および UPLC 分析後のアミノ酸について、また LC-MS/MS を使用してビタミンについて実施しました。

代謝物の測定は、Cedex Bio HT を用いて、光度測定法と濁度測定法に基づいて実施しました。モノクローナル抗体の特性評価は、グリカン分析には 2-AB 標識、電荷変異体分析には cIEF、ペプチド マッピング実験には LC-MS/MS を使用して実施しました。修飾システイン誘導体を含む飼料の安定性試験では、分子は安定しており、室温または 4 °C で保存した場合、3 か月間 L-システインまたは L-シスチンは放出されないことが示されました。さらに、飼料の色は経時的に変化しませんでした。L-システインを同量の化学的に修飾されたシステインに置き換えた小規模バッチ実験では、成長または生存率プロファイルに変化は見られませんでした。小規模フェドバッチプロセスでの修飾システイン誘導体の使用は、確立された 2 つの飼料システムと比較して、同等の最大生存細胞密度、生存率の延長、および力価の増加を示しました。

バイオリアクター実験では、単一供給戦略を2供給戦略と比較した場合、小規模で説明されている比生産性の向上が確認されました。モノクローナル抗体の詳細な特性評価では、グリコシル化または電荷変異パターンに変化は見られませんでしたが、ペプチドマッピング実験では、モノクローナル抗体の配列に修飾アミノ酸の統合は検出されません でした。モノクローナル中和剤（mAb）の作成のための哺乳類処理凝集体形態は、培養時間を延長し、タンパク質生産を向上させるために、グルコース、栄養素、アミノ酸などのいくつかの栄養素の重要な処理に依存しています[1]。実際のプロセスでは、L-システインとL-チロシンは、中性pHでの安定性と溶解性が低いため、可溶性pHで個別に処理され、pHの上昇と沈殿を引き起こします[2]。最先端の形態を改善するために、両方のアミノ酸は、それぞれの硬度と溶解性プロファイルを向上させるために人工的に変更されています。過去の研究では、ホスホチロシン二ナトリウム塩（PTyr2Na）は安定したL-チロシン誘導体であり、中立pH処理で使用しても、ライフスタイルのパフォーマンスやmAbの品質特性に検出可能な影響を与えることはないことが示されています[3]。ここでは、中立pHの単一フィードシステムでL-システイン誘導体を使用して得られた結果を示します。

L-システイン誘導体の安定性は、中性 pH の CellventoTM Feed-220 で、室温または 4°C で 1 週間にわたって評価されました。管理されたグループ ソサイエティでは、ヒト mAb を組み込んだ CHO K1 クローンを使用しました。増殖は、製品の手順書に従って Cellvento™ CHO-220 培地システムで実施しました。コントロールには、Cellvento™ Feed-220 と別の基本的なシステイン/チロシン フィードを使用しましたが、単一フィード プロセスでは、L-システイン誘導体と PTyr2Na は中性 pH のプライマリ フィードで直接溶解されました。試験は、シングル チューブと 1.2L バイオリアクターで実施しました。増殖と安定性は ViCell® を使用して観察し、力価は Cedex Bio HT を使用して決定し、特定の効率は力価、重要な可能な細胞密度、および衰弱に基づいて決定しました。

使用済み培地の分析では、L-システイン誘導体およびアミノ酸の測定を、AccQ·TagTMUltra試薬を使用したUPLCで実施しました。フィードの応答能力を評価するために、H2DCFDAを中性pHに加え、Cellvento™ Feed-220を誘導体で強化または非強化しました。細胞内応答種評価では、細胞をカルボキシ-H2DCFDAで標識し、蛍光を測定しました。細胞の誘導体使用能力を評価するために、細胞溶解物にスパイクを加え、成形物をUPLCで評価しました。mAb分析では、2-AB標識後にHPLCを使用してN-グリコシル化を測定し、cIEFを使用して電荷変化を解析しました。

中性 pH フィードでの L-システイン補助物質の安定性の調査では、室温または 4°C で 4 ヶ月以上保存した場合、補助物質の固定化や L-システイン/L-シスチン放出に変化がないことが示されました。沈殿や色の変化は見られず、補助物質はテストされた条件下で安定していることがわかりました。シングルフィード プロセスによるターン チューブでのコントロールされた束の成長により、コントロール条件と比較して最終生存率が高くなり、最終力価が向上しました。ターン チューブの結果はバイオリアクターで確認され、シングルフィード プロセスで最終生存率が高く、力価が高く、特定の生産性が高くなりました。

H2DCFDA を中性 pH に希釈した後、色素酸化が低いことが確認されました。この誘導体を含む Cellvento™ Feed-220 は、フィード単独と比較して、受容能が低いことが示されました。カルボキシ H2DCFDA を希釈してチューブの単一フィード処理されたクラスター集団に添加すると、細胞内色素酸化が低くなり、誘導体を使用した場合に細胞内受容性種年齢が低下することが示されました。細胞溶解物に添加すると、システイン誘導体はシステインに置き換えられました。導入された mAb では N グリコシル化または電荷変化に違いは見られず、誘導体が導入された基本的な品質特性に影響を与えないことが示されました。この試験は、L-システイン誘導体と PTyr2Na を中性 pH 処理に組み込むことができ、処理されたクラスター形態で L-システイン源として使用でき、mAb の基本的な品質特性に影響を与えることなく、従来のプロセスと比較してより高い特異的効率が得られることを示しています。