発がんと突然変異誘発のジャーナル

概要

E18 細胞モデルを使用した DNA 鎖切断関連傍観者効果 (DSB-ABE) の定量化

ジャラル・ナシル

リンパ芽球細胞株 E18 は TK6 の派生株であり、ヘテロ接合性TK1 / tk1遺伝子のイントロン 2 に I-Sce1 挿入部があります。E18 は I-Sce1 制限エンドヌクレアーゼで標的化され、I-Sce1 部位で二本鎖切断を誘発して、放射線非依存 DNA 損傷とそれに伴う傍観者効果を測定できます。E18 細胞株の構築では、pTK-UAS 線状化プラスミド バックボーンに Eco47III 部位が挿入され、DNA リガーゼの存在下で ISce1 制限配列の平滑末端オ​​リゴヌクレオチドとアニールされました。DH5-α 細胞は、pTK-UAS-Eco47III-Sce1 で細胞を熱トランスフェクトし、アンピシリン耐性コロニーを選択することで形質転換されました。プラスミド DNA を抽出し、Eco47III および I-Sce1 部位の存在について分析しました。チミジンキナーゼ活性対立遺伝子のイントロン 2 に I-Sce サイトを持つクローンを選択して、さらなる実験を行い、E18 と名付けました。このモデルは、二本鎖切断によって誘発される突然変異を実証するためにテストされ、これらの鎖切断は、ナイーブ細胞での突然変異頻度の増加によって測定される DNA 鎖切断関連バイスタンダー効果 (DSB-ABE) も生成する可能性があります。GFP マーカーを運ぶプラスミド pAdTrackCMV I-Sce1 を E18 細胞に電気穿孔し、活性 TK 対立遺伝子のイントロン 2 にある I-Sce1 サイトを特異的に標的とする I-Sce1 制限エンドヌクレアーゼを発現させました。突然変異率アッセイを使用して、直接突然変異率 (DMF) を測定するか、またはナイーブ細胞への調整培地の移入を伴ってバイスタンダー突然変異率 (BMF) を測定しました。これは、pAdTrackCMV I-Sce1 を介した外因性 I-Sce1 発現で E18 を標的とし、DNA 損傷を誘発して DMF と BMF を定量化するというエンドポイントです。