微生物および生化学技術ジャーナル

概要

細菌のqPCR検出における前処理の影響 - 細菌指標、モデルとしての腸球菌

シン・ギェック・ゴーとカリーナ・ユーフン・ジン

現在のレクリエーション用水ガイドライン（例：USEPA および WHO）では、淡水と海水の両方の指標として腸球菌を推奨しています。培養ベースの方法は、腸球菌の存在を定量化するために何十年も使用されてきました。2012 年に、レクリエーション用水に関する USEPA ガイドラインに、腸球菌を検出するための代替方法として qPCR が含まれていました。qPCR 法は、培養ベースの方法のように長いインキュベーション時間を必要としません。さらに、高い特異性と感度検出の利点があります。ただし、qPCR には 3 つの主な制限要因があります。qPCR で分析される少量のサンプルでは標的細胞が限られていること、qPCR の感度検出に簡単に影響を与える可能性のある阻害剤の存在、qPCR で偽陽性信号を引き起こす遊離 DNA（死んだ細胞から放出された DNA）の持続性です。そのため、上流の処理が qPCR 検出の精度に重要です。3 つの異なる事前濃縮方法 (i) ナイロン膜によるろ過。 (ii) ポリカーボネート膜によるろ過、および (ii) 遠心分離の回収率を調べました。ポリカーボネート膜によるろ過では、サンプルマトリックスに関係なく、より高い回収効率と一貫性のある結果が得られました。従来の DNA 抽出と 2 つの市販の DNA 抽出キットを、抽出された DNA の純度と抽出の相対的な回収効率に基づいて評価しました。結果は、市販のキットである QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen) が最高のパフォーマンスを示したことを示しています。QIAamp® DNA Mini Kit にシリカ膜を適用すると、阻害物質の干渉を最小限に抑えながら DNA の回収率が向上することが証明されました。エチジウムモノアジド (EMA) とプロピジウムモノアジド (PMA) について、qPCR での偽陽性シグナルの低減におけるパフォーマンスを評価しました。PMA は、膜が損傷した細胞での DNA の偽陽性検出を低減するためのより良いオプションであるように思われました。