幹細胞研究と治療のジャーナル

概要

マウス間帯細胞のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション：層の選択とRNA収量の予測

フロリアン・ジェンナー、ゲルジョ・JVM・ファン・オシュ、マイリード・クリアリー、アイリス・リビッチ、ウルリッヒ・ザウアー、ルネ・ファン・ウェーレン、ピーター・ブラマ

目的: 関節軟骨細胞は、胚発生中の関節のいわゆるインターゾーンに位置する前駆細胞の明確なコホートに由来します。この研究は、1) 補助的な in situ ハイブリダイゼーションや免疫組織化学なしで、中間および外側インターゾーン層を組織学的に (クレシルバイオレットを使用して) 識別できるかどうかを確認すること、2) 遺伝子発現分析を可能にするために個々の胚の各インターゾーン層から十分な量の RNA を採取できるかどうかを確認すること、3) コストのかかる増幅ステップの前に RNA 収量の概算を提供できる測定方法を開発することを目的として実施しました。方法: 妊娠 13.5 日と 15.5 日のマウス胚の新生大腿脛骨関節の外側 (OI) および中間 (II) インターゾーンと大腿骨および脛骨の骨端軟骨 (EC) から、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション (LCM) を使用して細胞を採取しました。続いて、マイクロアレイ解析を行って、適切な層選択を確認した。採取した表面積と、LCM 中に撮影した顕微鏡写真のグレー値 (gv) を測定し、対応する相対光学密度 (ROD) を計算し、RNA 収量との相関の程度と重要性を判定した。結果: OI、II、EC の細胞は、クレシルバイオレット染色を使用して組織学的に識別でき、LCM を使用して正常に採取され、線形増幅とマイクロアレイ解析に十分な量の RNA が得られた。RNA 収量は、採取した組織表面積、平均 gv、対応する ROD と有意に相関していた。結論: この研究は、マウスの中間層と外層のインターゾーン細胞の選択的レーザーキャプチャーマイクロダイセクションとそれに続くマイクロアレイ解析の技術を提供し、採取した組織面積を測定して ROD を計算することで RNA 収量を推定する方法を提示している。線形 T7 ベースの増幅とそれに続くマイクロアレイ解析に使用できる約 10 ng の総 RNA を得るために、13.5 日齢のマウス胚から最低 1×106 μm2、15.5 日齢のマウス胚から最低 3×106 μm2 を採取することをお勧めします。