ファーマシューティカ アナリティカ アクタ

概要

組換えタンパク質を用いた Cyp3a4 代謝依存性阻害と並行した可逆的なシトクロム P450 阻害のスクリーニングのための迅速かつ費用対効果の高いアッセイの開発

セレネラ・ザンボン、ステファノ・フォンタナ、ラファエレ・ロンギ、マフムード・カジバフ

本研究では、組み換え発現した P450 アイソフォームと蛍光発生 P450 基質を使用して、可逆的阻害と CYP3A4 代謝依存性阻害 (MDI) の両方を検出できる、高品質で迅速かつ費用効果の高い CYP450 阻害アッセイを開発しました。 CYP3A4 アイソフォームは、プローブ基質としてジエトキシフルオレセイン (DEF) を使用してスクリーニングされます。その後、10 分間測定されたプローブ基質の代謝速度に基づいて、CYP3A4 アイソフォームに対する試験化合物の IC50 値を計算できます。さらに、試験化合物の CYP3A4 代謝依存性阻害能は、ジエトキシフルオレセインの代謝速度の測定を 30 分間延長し、インキュベーション期間の 5 分ごとに IC50 値を計算することによって決定されます。試験化合物の CYP3A4 代謝依存性阻害能の推定値は、10 分および 30 分のインキュベーション後に測定された IC50 値を比較することで決定できます。インキュベーションは、直接 P450 阻害には選択的 CYP 阻害剤ミコナゾール、代謝依存性阻害にはトロレアンドロマイシンを陽性対照として使用して実施しました。スクリーニング プロセス全体は、2 台の蛍光光度計 (Tecan) とカスタム ラボ情報管理を組み合わせたハミルトン液体処理ロボット技術を使用して、96 ウェル プレート形式で完全に自動化されました。このアッセイは現在、リード最適化プロセスの早い段階で化合物をスクリーニングし、可逆的および/または代謝ベースの CYP450 阻害を引き起こす化合物を特定して、可能な限り DDI の可能性が低い分子または化学シリーズを進行させるために適用されています。このアッセイで生成される大量のデータは、有益なデータベースを構築し、予測モデルを改善するためにも使用できます。