栄養障害と治療のジャーナル

概要

臨床栄養学 2019: マウスの腸管健全性に対するコンブチャ茶の効果 - エラヘ・マフムディ - アルボルズ医科大学

エラヘ・マフムディ

目的:酸化ストレスは、心血管疾患の罹患率および死亡率の危険因子である過食症の発症に関係しています。いくつかのヒト研究では、トマトのカロテノイドが人間の健康のさまざまな側面に影響を及ぼす可能性があることが示されています。このプレゼンテーションでは、2つの問題について説明します。a) 紫外線照射に対する皮膚細胞の反応のバランスをとること、b) バイタルサインの上昇の軽減。a) いくつかのヒト研究では、トマトのカロテノイドは紅斑を軽減し、コラーゲンの生成と分解のバランスを改善することで、紫外線による損傷を軽減できることが示されています。トマトのカロテノイドとポリフェノールの混合物は、それらの活性の合計から予想されるよりも優れた皮膚保護をもたらす可能性があるという仮説を立てました。実際、トマト栄養複合体（リコピンを含む）とローズマリー抽出物（ポリフェノールのカルノシン酸を含む）の混合物は、炎症マーカーを相乗的に減少させ、皮膚細胞における抗酸化活性を誘導し、主にマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）を減少させ、コラーゲンの分解を減らし、皮膚の老化を遅らせる可能性があることがわかりました。b) 高血圧は、心血管疾患の罹患率と死亡率の危険因子である可能性があります。高血圧患者の正常徴候を維持するのにトマト栄養複合体サプリメントの最適な有効用量を明らかにするために、用量反応分析を実施しました。 材料と方法：

7 日間、飲料に溶かしたデキストラン硫酸ナトリウムを使用して、2 つの幼若マウスと成体マウスのグループで fKT を誘発しました。以前、大腸炎にかかったマウスに fKT を投与し、年齢を合わせた大腸炎の正常マウスおよび未治療マウスと比較しました。

コンブチャティー（KT）の作り方

紅茶（ゴレスターン、テヘラン、イラン）を沸騰水（1.2%w/v）に加え、混ぜて10分間浸出させた。その後、茶を滅菌ふるいで濾過し、スクロース（10%）を茶に溶かした。KTを調製するために、冷却した茶200 mlに、3%w/vの茶菌と、事前に発酵させた10%v/vのKT液を接種した。その後、収集物を28°Cで14日間インキュベートして発酵させた。濾過KT（fKT）を形成するために、得られた発酵茶を5000rpmで20分間遠心分離し、エアポンプを備えた0.45µmセルロースフィルターを使用して濾過した。

実験グループと研究デザイン

Male NMR mice were purchased from the Pasteur Institute Experimental Animal Center, Tehran, Iran. All animals were housed for one week before the experiments began in light- and temperature-regulated rooms at the traditional animal department of Alborz University of Medical Sciences.  All experimentations were permitted by the native ethical group (reference No Abzums.Rec.1395.51) and performed consistent with Animal Care and Use Protocol of Alborz University of Medical Sciences.

The animals were divided into two groups of young and old. Each group was then further subdivided into two groups (8 in each) including normal and colitis-induced. because the figure indicates, each of colitis-induced old or young groups was further subdivided into two subgroups, including colitis-induced with no treatment and colitis-induced treated with fKT. The study was performed in three phases. within the initiative , DSS-induced colitis was found out in young (2 months) and old (16 months) mice during a period of 21 days during which weight loss and therefore the clinical score were evaluated and compared with the age-matched healthy animals. within the second phase, the effect of fKT administration on survival analysis and therefore the clinical score were evaluated during a period of 21 days. After completion of phase I clinical trial and II of the study, molecular and histological evaluations were performed on young and old healthy controls, DSS-induced colitis, and DSS-induced colitis treated with fKT animals in phase III clinical trial . Considering the deathrate and clinical signs that occurred within the animals with colitis, animals at this phase of the study were sacrificed on day 14 after the start of the study.

Colitis induction

Colitis was induced on day 0 using administration of drinking water containing 3.5% (w/v) dextran sodium sulfate salt (DSS) (40000 kDa, MP Biomedical, Eschwege, Germany) per mouse per day. The animals and clinical signs of disease were daily monitored, indicated by weight loss, occurrence of blood in the stool or around the rectum, and diarrhea until day seven after the colitis induction. Weight loss was determined by comparing the body weight for each mouse to the baseline body weight and expressed as a percentage of weight loss. Other symptoms were scored according to the previously suggested system by Siegmund et al. Briefly, the different signs for stool consistency were scored as follows: score 0, well-formed pellets; score 2, pasty and semi-formed stools that did not adhere to the anus; score 4, liquid stools that did adhere to the anus. The different signs for bleeding were scored as follows: score 0, no blood measured using the Hemoccult system (Beckman Coulter); score 2, positive Hemoccult; score 4, gross bleeding. Animals with borderline scores were given a one-half score.

Histological and histopathological analysis

To perform histological evaluation of the colon, the animals were sacrificed under ether anesthesia after the last treatment with beverage or fKT. Colon was initially flushed with 1x ice-cold phosphate buffered saline (PBS) to get rid of feces completely. Tissue samples of the colon were then removed, fixed in 10% buffered formalin, and processed for paraffin sectioning. Sections of about 5 μm thickness were taken and stained with Hematoxylin and Eosin (H&E). The stained sections were examined with an Olympus cX41 microscope and photographed using an Olympus D330 camera . Damage score ranged from 0 to 4 scale was judged based on: inflammation represented by number and extent of leukocyte infiltration, epithelial defects represented by the severity of injury to the somatic cell layer, crypt atrophy estimated visually for the percent of atrophy within the crypts, edema, polymorphonuclear cells(PMNs) infiltration, and mucosal disruption.

Immunofluorescence studies of ZO-1 and ZO-2 expression

Sections of 5 µm paraffin-embedded colon tissues were prepared from each sample and then dewaxed, hydrated, and incubated in a protein block solution. Subsequently, the sections were incubated with the primary rabbit monoclonal ZO-1 or ZO-2 antibody (diluted 1:100 in 0.01 mol /L PBS; Zo-1: ab214228, Zo-2: ab2273, UK) followed by incubation with a goat anti-rabbit Alexa flour 488 (ab150077, Abcam, Cambridge shire, UK). The images were captured using a DeltaPix fluorescent microscope (Smorum, Denmark) and evaluated independently by two expert pathologists.

Analysis of gene expression by real-time PCR

Total RNA was extracted from ~50 mg of frozen colon tissue using guanidine/phenol solution (reagent lysis Qiazol-USA) consistent with the manufacturer’s instruction. the standard and quantity of RNA concentrations were monitored employing a NanoDrop 2000c (Eppendorf, Germany). Then, 1 μg RNA was reversely transcribed to DNA using Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Munich, Germany), consistent with the manufacturer’s instructions. The relative expression of mRNA for GAPDH, ZO-1, and ZO-2 decided by preparing reaction mixer with PCR Master Mix (2X) (Amplicon-Denmark) and gene-specific primers with diluted cDNA and final volume made up to 10 μl with nuclease-free water. Quantification and analysis were administered in ABI real-time PCR. The sequences of primers, designed by Integrated DNA Technologies, were forward 5′-TGTCCCACTTGAATCCCC-3′ and reverse 5′-TGTTTCCTCCATTGCTGTG-3′ for ZO-1 and forward 5′-CTCCCTCTTCACATCTGCTTC-3′ and reverse R: 5′-CTGTTACTTGCTTTGGTCTGG-3′ for ZO-2. The efficiencies for primers utilized in the study varied between 95% and 105%. Primer pairs were validated to make sure the right size of the PCR product and therefore the absence of primer dimers. The GAPDH gene was chosen as an indoor control against which mRNA expression of the target gene was normalized. The resultant organic phenomenon level was presented as 2-ΔCt, during which ΔCt was the difference between Ct values of the target gene and GAPDH.

Statistical analysis

Statistical analysis was performed using Graph Pad Prism 7.01. Data are presented as means± SD. ANOVA was wont to indicate any significant difference between the groups. Survival rates were illustrated using Kaplan–Meier plots and compared using the log-rank test. Value of P was considered statistically significant when it had been but 0.05.

Results:

Characteristics and clinical course of DSS-induced colitis

マウスにおける DSS 誘発性大腸炎は、大腸炎の病因を扱い、治療法を評価するための一般的な動物モデルです。このモデルは当研究所で発見され、21 日間 (フェーズ I) にわたって監視されました。そのために、雄の NMR マウスに 7 日間、飲料に 3.5% DSS を投与しました。研究期間中、動物は毎日、生存率、体重減少、出血や下痢などの大腸炎の臨床兆候について検査され、年齢を合わせた健康な動物と比較されました。 DSSを投与された若い動物の生存率解析では、7日目と14日目にそれぞれ66%と33%の動物が生存していたが、2日目に全頭が死亡したことが示された。DSSを投与された老齢動物の場合、生存率解析では、7日目と14日目にそれぞれ66%と50%の動物が生存していたが、21日目に全頭が死亡したことが明らかになった。年齢を合わせた健康な動物と比較すると、DSSを投与された若いグループと老齢グループでは大幅な体重減少が見られた。DSSを投与された若いマウスは、7日目と14日目にそれぞれ約10%と46%の体重が減少した。DSSを投与された老齢マウスは、7日目と14日目にそれぞれ約13.5%と15%の体重が減少した。消化器疾患の兆候については、DSSを投与された若いマウスと老齢マウスで、DSS投与後2日目と3日目にそれぞれ出血と下痢が観察された。これらの結果は、DSS 治療を受けた若いマウスは、DSS 治療を受けた老齢マウスよりも重篤な臨床症状を示し、生存率が低いことを示しています。

組織学的観察

DSS に曝露されたすべての若いマウスと老齢マウスの H&E 染色組織切片の組織学的分析 (図 6) では、同年齢の健康なマウスと比較して、PMN の浸潤、潜在性喪失、上皮欠損、粘膜破壊、アポトーシス、浮腫、粘膜菲薄化が増加していることが示されました。fKT による治療では損傷の程度が減少しましたが、この研究で実施されたレジメンでは完全に健康な状態に戻ることはありませんでした。特に、健康な老齢マウスでは、若い健康な動物と比較して、PMN の浸潤、潜在性喪失、浮腫が多く見られました。図 6c に示すように、DSS 誘発性大腸炎の臨床スコアが若いマウスと老齢マウスの両方で増加したため、粘膜の厚さは DSS 投与によって減少しました。 この研究の一部は、2019年3月4日から6日にスペインのバルセロナで開催された第24^回 国際臨床栄養会議で発表されました。